非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法的建立

默瑞生物推出现货（TwistAmp Liquid Basic kit/TwistAmp EXO kit）液态重组酶聚合酶扩增 (RPA)试剂盒，这些试剂盒非常适合需要不使用热循环仪就能在15分钟内完成 DNA/RNA 扩增的实验室以及想要灵活构建试验体系的研究人员使用。

TwistAmp® Liquid试剂盒提供经甘油稳定化处理的液态RPA试剂，该形态对于在实验室执行 PCR 和其他基于酶的反应的任何人来说都非常熟悉。这些试剂各自装于单独的试管中，用户可随意从中移取任何量的酶混合液来构建自己所选的RPA反应体积，配制用于多次反应的预混液，或者以各种 RPA 组分比例进行实验以优化试验。

除了具有室温稳定性的冻干态TwistAmp® RPA试剂盒这一旗舰产品，本次新推出的 TwistAmp® Liquid试剂盒是现场或定点试验开发的理想之选。液体形态让实验室更容易地在日常工作中使用快速简单的RPA法（该方法有时甚至采用与PCR相同的引物）取代 PCR法，以及更容易地开发出定制的试验。

TwistAmp利用RPA恒温扩增技术发表的论文

1. https://www.nature.com/articles/s41598-018-35636-5

Development of real-time reverse transcription recombinase polymerase amplification (RPA) for rapid detection of peste des petits ruminants virus in clinical samples and its comparison with real-time PCR test 实时反转录重组酶聚合酶扩增技术（RPA）的研究进展

2.https://brill.com/view/journals/nemy/21/3/articlep243_2.xmlRecombinase polymerase amplification assay for rapid detection of the root-knot nematode Meloidogyne enterolobii重组酶聚合酶扩增法（RPA）快速检测

3. http://www.chvm.net/EN/abstract/abstract7141.shtml›› 2017, Vol. 44 ›› Issue (11): 3270-3277.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.11.023Establishment of a Real-time Fluorescent Recombinase Polymerase Amplification (RPA) for the Detection of African Swine Fever Virus非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法的建立

HADENG Chu-riya1,2, FAN Xiao-xu1, ZHAO Yong-gang1, WANG Shu-juan1, ZHANG Zhi-cheng1, GE Sheng-qiang1, LI Lin1, WU Xiao-dong1, WANG Zhi-liang1

1. National Research Center for Exotic Animal Disease, China Animal Health and Epidemiology Center, Qingdao 266032, China;2. College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失.本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对ASFV B646L(p72)基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法.结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×106至5.5×100拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38％～28.30％.该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义.

1.https://journals.plos.org/plosone/article;id=10.1371/journal.pone.0166903RecombinasePolymerase Amplification Assay—A Simple, Fast and Cost-Effective Alternative to Real Time PCR for Specific Detection of Feline Herpesvirus-1 重组酶聚合酶扩增法（RPA）-一种简便、快速、经济的猫疱疹病毒-1特异性检测方法

· Jianchang Wang,

· Libing Liu,

· Jinfeng Wang,

· Xiaoxia Sun,

Wanzhe Yuan

2. https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac5011298Quantification of HIV-1 DNA Using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification 监测HIV的新型移动DNA检测技术（RPA技术）

2014年6月9 讯 /生物谷BIOON/ --近日，刊登在国际杂志Analytical Chemistry上的一篇研究报告中，来自美国莱斯大学的科学家通过研究开发了一种简便高准确率的检测技术，来检测患者机体中的HIV迹象及病情发展程度。

研究者Rebecca Richards-Kortum表示，当前用于诊断婴儿HIV状况的金标准就是依赖实验室设备及当前可用的检测技术来对其机体中的病毒载量进行监测，而本文中研究者则开发出了基于核酸的新型HIV检测技术。

这项新型的检测技术基于PCR的方法对重组聚合酶进行放大（RPA），从而取代了复杂的实验室检测步骤，其可以对血液中的遗传标记物进行快速多重放大，从而使得病毒的遗传标记物可以很容易被检测到；利用qRPA检测就可以对HIV DNA中的特殊序列进行荧光探针的靶向标记，从而使用机器进行定量检测，最后通过对荧光DNA进行软件分析就可以使得医生们掌握HIV在患者机体中的动态信息。

Rohrman教授说道，我们可以通过放大内部阳性对照对测试进行校准，而且可以利用HIV序列的相同引物进行扩增，因此检测实验可以正常进行；这项新型技术可以帮助追踪老年患者机体中的病毒载量，这对于临床医生们实时监测病人体内的HIV情况，从而来确定患者是否需要及时治疗提供了一定的参考数据。

从临床角度来讲，基于DNA的HIV检测可以在四个数量级上对HIV的病毒载量进行定量检测，尽管当前研究者使用热循环仪来进行检测，但是研究者正在着力开发一种新型的检测技术，使得整个操作步骤维持在室温和体温之间，从而确保实验的通用性和准确性。

附: TwistAmp liquid试剂盒Q&A

Q 20x核心反应mix有沉淀,是否影响其功能?

A在低温保存时, 重组酶和辅助蛋白在50%甘油中20x核心反应mix中有时会发生可逆的共沉淀反应.所以在室温融化混匀后离心使其返回溶液形式并不影响其功能。

Q 使用Liquid试剂盒做多重实验，能否制备master mix?

A 可以。Oligos, 2x Reaction Buffer, water, dNTPs and 10x E-mix可以预先混合，置于冰上几个小时，在很多实例中可以过夜保存（性能上有任何改变都需要客户自行实验和评价）。一旦加入20x核心酶，短期保存在冰上也是可以的。

Q 使用Liquid试剂盒如何提高重复率和RNA模板的扩增率?

A 先将RNA模板和醋酸镁混合后加入反应体系中，RNA的三级结构会抑制逆转录酶的活性，所以加入RNA和醋酸镁时，将两者分别加到在管内壁两侧或者将醋酸酶加在管内盖中，同时离心混入体系，这种操作会提高反应性能。

Q 在TwistAmp Liquid E-mix中有沉淀，还能使用吗?

A 可以。少量磷酸肌酸会发生沉淀不会影响RPA反应，只需在实验前通过涡旋将沉淀重悬离心即可。

Q 在使用Liquid试剂盒时，是否能够使用dUTP/生物素（酰）化dUTP?

A 可以，请参考

http://dx.doi.org/10.7150/thno.15250 和 http://dx.doi.org/10.1186/s13148-015-0100-6

Q 最小的RPA液体反应体系是多少?

A 最小低至PL级，请参考

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0153359

Q 液体反应体系中需要加入多少dNTPs?

A 1.8mM(总)dNTPs 作为起始量即可。用户也可以根据自身实验优化浓度,有时1-12mM均适用。

Q 如何提高扩增曲线的可重复性?

A 优化扩增曲线考虑以下因素: 对于低拷贝数模板，不稳定扩增可能是因为达到检测限或者是反应混匀程度不同（未混匀的反应扩增效率不佳）。另外，在低温情况下存贮，重组酶和辅助蛋白在50%甘油情况下形成沉淀,也是可能导致不稳定扩增的原因。所以，20x核心反应mix在室温下解冻并震荡涡旋将使其成为液体，不影响其功能,并且有效提高扩增效率。不稳定扩增也可能是因为master mix量不足，在加入体系前，用户必须保证震荡后20x核心反应组分均一。默瑞生物

默瑞(上海)生物科技有限公司，作为专业的生命科学产品推广与服务商，以“创新，专业，共赢”的理念，不断强化服务体系，提升客户体验，以莫纳生物产品为主线，结合国内外优质产品提供高标准完整解决方案，帮助科研客户和生物技术企业高效创新，加速转化，创造更多优质产品，提升社会福祉，实现多方共赢。

默瑞生物创立以来，已经陆续导入

TwistDx,Immunostep,101Bio,enzymatics,AATBioquest,KAPABIOSYSTEMS,BioDynami,Jackson,Echelon,ChromoTek,Nanocs,Biotechrabbit,LeeBiosolutions, magtivio等优质国际品牌，逐步培育成为专业用户的选择。

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